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84農業網 時間：2018-03-15 作者：佚名 來源：網絡整理
油菜是重要的油料作物，對油菜的改良是育種家們長期努力的目標。據報道，1998年全球轉基因油菜種植面積為240x104hm2占全球油菜種植面積的9％，1999年增至280x104hm2，占全球油菜總面積的11％，2000年全球轉基因作物面積為4420x104hm2，占全球作物種植面積的16％(官春云，2002)。多年來，許多育種工作者試圖采用傳統的育種手段來獲得油菜良種，但進展十分緩慢。隨著基因工程技術的發展，人們愈來愈傾向于通過基因工程的手段改良油菜的產量、品質及抗逆性。因此，建立良好的油菜轉化體系至關重要。
1油菜轉基因的受體系統及篩選標記
1.1受體系統
植物轉基因受體系統是指選擇合適的器官、組織或細胞進行轉基因后，能通過組織培養或其它途徑再生出新生植株的無性繁殖體系。因此，適宜的油菜轉基因受體系統的建立，是創造轉基因油菜的關鍵環節。
1.1.1子葉、下胚軸受體系統
Moloney等(1989)年發現蕓薹屬植物種子萌發以后，切取帶有1-2mm子葉柄末端切口處的細胞不但再生能力強，而且易被農桿菌感染和轉化。近年來，國內外許多學者分別以油菜的子葉、下胚軸、莖段為受體進行基因轉化。Pua等(1987)建立了莖段再生體系，并以此為受體，轉化率為10％。Moloney等(1989)以葉柄為受體的轉化率為55％。以子葉、下胚軸、莖段為受體，具有簡便、快速、轉化率高f1.5％～55％)等優點。但再生植株易為嵌合體，基因型也可能是雜合的(段英姿等，2003)。
1.1.2原生質體受體系統
自1972年第一株煙草體細胞雜種植株問世以來，原生質體融合技術在不斷完善和發展。油菜的原生質體培養起步于20世紀70年代，到目前為止，在栽培油菜的3個種中都利用原生質體培養獲得了再生植株(Chieneta1，1982；Glimeliuak，1984；Puite，19921。以原生質體為受體能得到高度純合體，但其再生及分化困難，轉化頻率較低，且操作復雜(段英姿等，2003)。
1.1.3小孢子受體系統
油菜小孢子培養和再生技術，在國內外已經發展的比較成熟。小孢子本身具有單細胞性和單倍體雙重特點。因此用它作為轉化受體進行外源基因導入，不僅有利于基因表達還可以加速轉基因材料的純合，而且可縮短育種年限。陳軍等(1998)以“中雙1號”、“中雙3號”、“中油821”、“89008”等油菜品種，建立了甘藍型油菜游離小孢子再生胚狀體的實驗體系，掌握了受體最佳發育時期，使再生頻率高達每花蕾21.2個胚狀體，并以此為受體得到轉基因植株。
1.2篩選標記
在植物轉基因工程中，如何選擇和篩選轉化體是一個重要的問題，在油菜轉基兇工程中應用到許多選擇標記基因和報告基因，使人們能快速、準確地從大量非轉化體中獲得轉基因植物。油菜較常用的篩選標記基因有新霉素磷酸轉移酶基因(NPTII)，潮霉素磷酸轉移酶基因(程振東等，1994)和二氫葉酸還原酶基因(Puaeta1，1987)及bar基因、Bt基因(衛志明等，1998)，它們分別介導對卡那霉素、潮霉素、氨基喋呤、除草劑、巴龍霉素的抗性。至于哪一種效果最好一定程度上取決于基因型和可利用的轉化載體，研究表明對不同基因型的篩選效果亦不同。篩選劑最常用的是卡那霉素，應用卡那霉素篩選不乏成功的報道，但有的學者認為(Puaeta1，1987)，卡那霉素對于甘藍型油菜來說，有時效果很差，這可能與基因型有關。潮霉素、慶大霉素、新霉素應用成功報道亦不少。Schr~der等(1994)研究了在甘藍型油菜轉化過程中4種選擇標記基因(nptⅡ，aadA，bar,Spt)在篩選過程中的效果，認為用aadA基因(介導對鏈霉素和壯觀霉素的抗性)作為標記對轉化體進行篩選最合適。
2油菜轉基因方法
在植物基因工程研究中，關鍵步驟之一是通過特定的方法將外源基因導入受體植物細胞內，使之發生定向的、永久性的遺傳變異，即所謂的植物遺傳轉化。為了方便有效地將外源基因導入植物體內，人們不斷地探索、發展新的植物遺傳轉化方法。目前應用到油菜轉基因中的遺傳轉化方法主要有農桿菌介導轉化法和外源基因直接導入法。
2.1農桿菌介導轉化法
農桿菌在侵染植物傷口時，可將其攜帶質粒上的一段DNA(T-DNA)整合到植物基因組上，并在植物體內表達。因此，農桿菌作為一種天然載體系統被廣泛應用到植物基因轉化中(表1)，成為植物基因轉化的首選方法。農桿菌介導的轉基因方法具有以下優點：不需要專門儀器；宿主范圍廣，包括大多數雙子葉植物和少數單子葉植物；插入外源基因的片段較大，可達50Kb以上；轉化率明顯高于其它直接轉化方法；外源基因整合到植物基因組上的拷貝數較少，多為單拷貝；整合的外源基因變異小，后代的分離規律也遵循孟德爾遺傳規律。缺點是仍受宿主范圍和菌株特異性等因素的限制(Santar6meta1，1998；TrickandFiner，1998)。
2.2外源基因直接導入法
在油菜的遺傳轉化中，有越來越多的研究傾向于采用外源基因直接轉化法，因其不受宿主范圍的限制，也不需使用特定的載體。在早期的油菜遺傳轉化研究中取得成功的方法有3種：電激法、PEG法和顯微注射法。近年來發展起來的還有基因槍法、激光微束穿刺法、真空滲入遺傳轉化法和花粉介導法等。
2.2.1電激法
電激法最初是從哺乳動物細胞轉化中發展起來的一門新技術，后來用于植物細胞的遺傳轉化。國外最早報道是1985年美國的Michael等將其用于植物轉基因上。Chapel和Gimelius利用電激法將B一葡萄糖醛酸酶基因(gus)導入甘藍型油菜的葉肉原生質體中，建立了瞬時表達系統。Guerche等(1987)利用此法將含卡那霉素抗性基因nptH導入甘藍型油菜中。自此，電激穿孔法先后在煙草、玉米、水稻、馬鈴薯、番茄、大豆、小麥等作物原生質體上獲得成功。
2.2.2顯微注射法
顯微注射法是使用專門的儀器將外源基因直接注入到生物的生殖細胞中，而獲得轉基因再生植株的一種方法。顯微注射法多年前在動物中就已獲得成功，由此促進了它在植物細胞中的應用。Neuhaus等f1987)以甘藍型油菜的花粉胚為受體，利用顯微注射法將nptll基因的外源DNA注入細胞中。但這一方法需以精細的顯微操作技術和細胞低密度培養為基礎，并且必須建立固定植物細胞或原生質體的技術。
2.2.3基因槍法
基因槍法是借用火藥爆炸、高壓氣體或高壓放電為動力，用微粒對植物進行轟擊而將其上的外源基因帶入到植物細胞內，此法可以不受基因型和轟擊靶組織的限制(崔欣等，2001)。目前基因槍法在油菜的遺傳轉化中已有成功的報道。Fukuoka等(1998)利用基因槍法轉化甘藍型油菜小孢子并獲得可育的轉化植株。國內方面，侯丙凱利用此法將從蘇云金芽孢桿菌中克隆得到野生型殺蟲晶體蛋白基因導入油 菜葉綠體中獲得4株轉基因植株(侯丙凱和陳正華，20011。但基因槍方法的缺點是轉化效率低，一般在0.1％-1％范圍內，增加了選擇的難度，且費用昂貴。
2.2.4真空滲入遺傳轉化法
真空滲入遺傳轉化法是一種簡便、快速、且無需經過組織培養階段即可獲得大量轉化植株的基因轉化方法。在油菜的遺傳轉化方面，目前國內已有成功的報道。張廣輝等(1998)利用真空滲入法，以白菜型油菜子葉為受體進行轉化，得到其轉化株，轉化率為2.11％。
2.2.5激光微束穿刺法
激光微束穿刺法是利用聚焦到微米級的激光微束對組織進行穿刺，引起細胞膜的可逆性穿孔，從而導入外源DNA的一種基因直接轉化技術。早在1987年，Weber等就利用微束激光將熒光素標記的外源DNA導入葉綠體中。這一技術操作簡便，轉化頻率高，定位準確，對細胞損傷小以及外植體適用性廣泛等優點。利用激光微束穿刺法導入植物的外源基因還有一些報告基因、篩選標記基因和抗病基因，侯丙凱首次報道利用激光微束穿刺法將殺蟲蛋白基因導入油菜，并獲得抗蟲轉基因植株的研究結果。
2.2.6PEG法
PEG融合法操作簡單，處理量大，融合頻率高，而且不影響再生，基本上已克服了再生植株是嵌合體情況的發生，而且不需要昂貴的儀器設備。其缺點是仍需進行原生質體培養、處理時問長、不易掌握、常形成多元原生質體融合體。有報道指出，將PEG法與電擊法等其他導入基因的方法相結合，能夠提高轉化率。程振東等(1994)用PEG法把外源基因導入甘藍型油菜原生質體并獲得了再生轉基因植株。
2.2.7花粉介導法
花粉介導法是山西省農科院生物中心的孫毅博士，王景雪博士等發明了一種新的植物轉化方法，即利用生殖細胞――花粉作為載體，結合超聲波處理介導外源基因對植物進行轉化。花粉介導法避免了其它轉化方法所要求的組織培養技術，轉化方法簡單、易操作、轉化率高、且費用低，具有很強的實用性。利用花粉介導法，王景雪等(2001)獲得了玉米轉基因植株，隨后解志紅(2002)用這種方法在棉花上進行了試驗，其轉化頻率為32％，杜春芳(2004)將GUS基因轉入油菜中，其轉化頻率為2.8％。
3油菜轉基因研究中的問題與展望
自1985年Ooms等利用農桿菌介導法獲得第一株轉基因油菜以來，轉基因油菜的研制在近十多年來發展迅速，一系列抗病、蟲、除草劑及高產優質的轉基因油菜相繼問世，抗蟲和抗除草劑轉基因品種已進入商業化生產。但是應該看到在油菜轉基因領域中還存在許多有待解決的問題。
3.1提高外源基因轉化率并建立高頻再生體系
目前雖然已獲得了許多轉基因油菜植株，但大部分都是經過了大量的重復實驗后僅得到的幾個轉化體克隆。一些轉化受體如小孢子、葉綠體等的轉化率一般在1％以下。另外一些轉化方法如基因槍法、激光微束穿刺法、真空滲入法等，其轉化率也很低，均達不到直接為生產服務的要求。因此，對現有的外源基因轉化方法作一些改進或建立新的基因轉化方法，提高轉化率，建立高效的基因轉化系統仍然是有待解決的問題。
3．2提高對轉基因油菜中外源基因的表達的調控及其遺傳穩定性
目前在油菜的遺傳轉化中，外源基因的插入整合基本上是隨機的，其表達水平、表達的部位及時問也大多不受控制，因此對外源基因的表達調控基本上處于失控狀態。另外，還有由于外源基因的隨機插入及拷貝數高而引起轉基因沉默現象。解決這些問題就需要深入研究植物的生長發育機理、采用特定的啟動子、使用植物偏好密碼子、研究及應用定點插入技術等方法。
3.3與傳統常規育種相結合
利用基因工程方法獲得的油菜轉基因植株只是一種人工種質新材料，要使其成為生產上可以應用的新品種就必須經過常規育種程序的考驗。轉基因植株須經大田試驗將外源基因持續遺傳給后代，建立遺傳穩定的品系，才可能最終取得經濟效益和社會效益。而在現在的油菜轉基因研究中，許多轉基因植株未能保存，或不能通過種子將外源基因的性狀遺傳給子代，而且采用的大部分基因為報告基因，沒有生產應用價值。
3.4轉基因油菜的安全性問題
隨著基因工程研究的進展，許多轉基因農作物也進入了實用化、商品化階段，而其安全性問題，也引起了廣泛的爭論，并且受到了各國政府的高度重視，轉基因油菜也不例外地存在安全性問題。轉基因油菜中的外源基因可來自植物、動物或微生物，一些基因雖已經過嚴格的安全性試驗后才被允許進入商業化生產，但人們對轉基因油菜仍然心存疑慮。但勿容質疑轉基因油菜是油菜科學研究和生產的一場革命。現存的問題將是推動轉基因油菜研究走向更加成熟、完善的動力，而不是阻力。
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