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84農業網 時間：2018-03-14 作者：佚名 來源：網絡整理
豬圓環病毒病是由豬圓環病毒(PCV)感染引起的，以免疫抑制為特征的一類病毒性傳染病，臨床表現主要是由PCV-2引起的仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征。文章就近幾年國內外對該病毒檢測技術，包括病毒分離、電鏡觀察、聚合酶鏈式反應、間接免疫熒光試驗、免疫組織化學技術、酶聯免疫吸附試驗、原位核酸雜交試驗等的研究進展做了闡述。
豬圓環病毒病是近年來倍受關注的一種在世界各地廣泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的總稱。自1974年TischerI等[1]首次發現豬圓環病毒(Porcinecircovirus，PCV)以來，隨著對PCV研究的深入，根據豬圓環病毒的致病性及其基因組差異又可將其分為無致病性的豬圓環病毒1型(PCV-1)和有致病性的豬圓環病毒2型(PCV-2)。PCV-1對豬無致病性，但能產生血清抗體，在豬群中普遍存在，接種2日齡與9日齡的豬無臨床癥狀。PCV-2對豬有致病性，主要導致一種以斷奶仔豬呼吸急促或困難、腹瀉、貧血、明顯的淋巴組織病變和進行性消瘦為特征的新的疾病，即斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)，造成了很大的經濟損失。由于豬群中普遍存在著PCV抗體，單一的抗體陽性不能確診為陽性，確診必須依靠實驗室方法檢測出PCV-2抗原或核酸。由于病毒復制困難，所以檢測和防控研究非常困難。同時，該病易與一些病毒性和細菌性疾病混合或繼發感染，因此僅憑癥狀、病變及流行病學調查很難做出準確判斷。為此，各國獸醫工作者進行了大量的研究，建立了多種高度特異性的病毒學、免疫學和分子生物學診斷方法。文章就目前國內外PCV的檢測技術研究進展進行綜述。
1 病毒分離
豬圓環病毒的分離培養多數是從病豬中采取肺、肝、脾、淋巴結和扁桃體等組織，制成組織勻漿，用氯仿處理除去有囊膜的病毒，接種PK-15細胞，利用氨基葡萄糖短時間處理感染細胞，以促進病毒的增殖。呂艷麗等[2]從北京、河北分離了3株PCV-2，并對其中的2株進行了測序，序列分析比較發現，它們與歐美分離毒株具有很高的同源性。郎洪武等[3]用Dulac豬腎傳代細胞分離到了2株圓環病毒。崔尚金等從我國的22個省市分離到了32株豬圓環病毒，并對其中6株進行了測序，呈送到GenBank。另外，還有很多研究人員從各地分離到多株豬圓環病毒。
2 電鏡觀察
電鏡下可以觀察到一種較小病毒，是豬圓環病毒特有的直徑約為17nm的球型結構，以及大量不同形態的胞漿內包涵體。
3 聚合酶鏈式反應檢測
聚合酶鏈式反應(PCR)做為一種快速、簡便、特異的診斷方法，目前為病毒學診斷、分子生物學實驗最常用的技術，其優點為敏感、特異、快速、準確。在PCV的檢測方面應用廣泛，且發展了很多改良的技術。
3.1 多重PCR檢測
HuangCI等[4]建立了一種簡單的多重PCR法，可對PCV進行檢測和定型。該方法設計了兩套引物，是根據PCV核酸鏈上的ORF1和ORF2設計的。CalsamigliaM等[5]建立了一種多重PCR法，可對PCV進行檢測和定型。作者根據PCV-1和加拿大PMWS豬中分離的PCV-2的ORF1和ORF2序列設計兩套引物，這兩套引物都可以對PCV進行檢測和定型。郎洪武等[3]根據PCV種的特異性和PCV-2型的特異性，設計兩對PCR引物，進行多重PCR檢測PCV。一對引物擴增出的片段具有PCV種的特異性，擴增區域是相對保守的ORF1部分核苷酸片段，大小約為900bp。另一對引物擴增出的片段具有PCV-2型的特異性，擴增區域呈可變性相對較大的ORF2部分的核苷酸片段，大小約為470bp。KimJ等[6]在2003年建立了石蠟包埋組織中同時檢測PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法，檢測了人工感染病例和自然感染病例，結果與原位雜交方法完全一致。
3.2 定量競爭性PCR檢測
定量PCR是根據PCR的產物量來推斷其原始模板量。LiuQ等[7]建立了競爭性PCR方法檢測血清中的PCV的DNA。選取PCV-1和PCV-2的ORF2中變異性高的區段設計兩對型特異性引物，并引入一個外源片段的重組質粒，以此作為競爭性模板，用上述兩對引物擴增出的PCV-1或PCV-2片段能夠與野毒株的擴增片段相區別。當倍比稀釋的已知濃度的質粒DNA和待測DNA共同的PCR產物的電泳條帶亮度相同時，便可以推算出待測DNA的濃度。崔尚金等[8]運用此方法在試驗過程中采用內標競爭模板，競爭模板和目標模板共用一個反應體系，不僅降低了非內標性模板不同PCR反應管間的差異，而且在對樣本進行質控監測，排除了假陰性結果。
3.3 復合PCR檢測
復合PCR是一種特殊的PCR技術，即在同一反應體系中加入多對引物，擴增多個基因片段，此法方便快捷，已廣泛用于醫學臨床診斷。蘆銀華等[9]應用復合PCR，在同體系中用3條引物擴增PCV兩種血清型的DNA片段，從而達到PCR擴增一次就可檢測鑒別PCV-1和PCV-2的目的。試驗從PK-15細胞中擴增出了PCV-1和PCV-2特異的基因片段，表明復合PCR方法的建立，為PCV的檢測、分型及臨床PMWS的診斷提供了有效的工具。朱軍莉等[10]采用復合PCR，對浙江、上海等地的豬場，具有明顯的“高熱綜合征”臨床表現豬的淋巴結進行檢測，發現PCV-2的陽性率為39.40%，而PCV-1的陽性率為33.33%。
3.4 PCR-RFLP檢測
PCR-RFLP是指在生物進化過程中，DNA堿基序列發生插入、缺失或突變，從而改變了限制性核酸內切酶的識別位點，是以PCR快速有效的擴增微量的DNA，再利用限制酶進行多態性分析的試驗方法。FenauxM等[11]利用PCR-RFLP對PCV-1和PCV-2進行檢測和定型。根據PCV-1和PCV-2的243bp片段，利用僅在PCV-2上有的限制性酶切片段位點NcoⅠ來鑒定PCV-1和PCV-2。PCV-2的PCR產物可被NcoⅠ切成168bp和75bp的兩個片段，而PCV-1上無NcoⅠ的位點，不能被NcoⅠ切割。這樣就可以直接區分PCV-1和PCV-2。經電泳分析，PCV-1的酶切片段仍是243bp，而PCV-2的酶切片段是168bp和75bp。呂艷麗等[12]采用PCR從豬的淋巴結和脾臟中擴增出了預期長度的PCV-2DNA片段，再用限制性內切酶EcoRⅠ酶切鑒定了PCV-2PCR產物的特異性。
3.5 其他PCR檢測
歐陽歲東等[13]報道，應用RT-PCR在福建檢測發現有豬PRRSV和PCV-2共同感染。龔振華等[14]設計了針對豬圓環病毒引物的PCR試驗，從細胞毒及組織中直接用水煮法提取核酸，操作簡便、快速，從核酸的制備到檢測出結果只需2.5h，大大縮短了檢測時間。KimJ等[15]建立了固定、石蠟包埋組織中最佳DNA提取及套式PCR檢測PCV-2的方法。
4 間接熒光免疫試驗
將組織病料接種PK-15細胞玻片培養，丙酮固定，用兔抗PCV高免血清與細胞培養物中的PCV反應，可對PCV進行檢測和定型。周繼勇等[16]報道，應用間接免疫熒光技術，測定了浙江地區44個豬場2000年－2002年的2039個血清樣本，對不同年齡和品種豬的血清學數據進行了系統分析。結果顯示，浙江地區44個豬場均有豬圓環病毒感染，平均陽性率為58.31%，其中種豬感染的血清陽性率為59.38%，斷奶以后豬感染的血清陽性率為56.65%。蘆銀華等[17]應用間接熒光技術對幾個地區的64份臨床血樣進行檢測，結果38份血清呈現PCV抗體陽性(59%)，表明PCV已在我國普遍流行。
5 免疫組織化學技術檢測
免疫組織化學技術(IHC)是在抗原抗體特異反應存在的前提條件下，借助于酶細胞化學的手段，檢測某種物質在組織細胞內存在部位的一門新技術，即預先將抗體與酶連接，再使其與組織內特異抗原反應，經細胞化學染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態學研究方法。StaeblerS等[18]利用單克隆抗體的IHC方法，對收集的469頭豬的淋巴組織和回腸的石蠟標本進行研究，這種單克隆抗體是針對PCV-2ORF2遺傳密碼的衣殼抗體。從28個農場的39頭豬的組織標本中檢測出抗體。KrakowkaS等[19]通過IHC和組織病理學對感染病毒豬進行檢測，確定了感染PCV-2的病毒載體，尤其是淋巴組織和肝臟，與感染PCV-2豬的臨床表現嚴重程度有直接關系。KimJ等[20]用IHC從流產胎兒和死產仔豬的巨噬細胞中檢測出PCV-2的抗原。
6 酶聯免疫吸附試驗
針對豬圓環病毒病血清學診斷方法，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是最主要的試驗方法。McKeownNE等[21]利用ELISA，表明由母源抗體產生的對PCV-2感染的保護是由滴度決定的，高滴度產生普遍保護，而低滴度則不產生。LiuC等[22]將編碼PCV-2結構蛋白(Cap)的序列克隆到桿狀病毒表達載體上，并將重組表達的Cap蛋白純化后作為ELISA的包被抗原。通過與免疫過氧化物酶單層試驗的比較，發現這種ELISA方法的敏感性和特異性都非常高，同時試驗表明與PCV-1、PRRSV和PPV都無任何交叉反應。殷鷹等[23]運用ELISA對來自重慶、內江兩地3個豬場的89份血清樣進行了PCV-2檢測，發現有陽性豬場。崔尚金等采用PCV抗原和正常細胞對照抗原，建立了間接ELISA，并被農業部推薦用于流行病學調查。
7 原位核酸雜交試驗
原位雜交組織(或細胞)化學技術(ISH)簡稱原位雜交技術，屬于固相核酸分子雜交技術，它區別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術。核酸雜交是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵形成穩定的雜交雙鏈。KimJ等[20]用ISH檢測了PCV-2的DNA。SegalesJ等[24]通過ISH得出器官損害的程度越嚴重，所測出的病毒基因的數量越多，在血清抽樣中測出PCV-2的遺傳量越高。國內對ISH的報道較少。
8 結語
PCV-2引起的PMWS迄今還沒有有效的治療方法，也沒有疫苗可以使用。目前對該病的防控措施還主要停留在加強飼養管理、降低飼養密度、減少應激、控制進出人員和車輛、加強早期疑似感染豬的診斷、隔離、淘汰等方面。國外對PCV的診斷技術進行了大量的研究，已建立了多種方法成功地檢測PCV的抗原、抗體和核酸。國內對PCV的研究還處于起步階段。由于我國是一個養豬大國，PMWS已在我國廣為流行，而我國對PCV病認識不足，尚未確立標準的診斷方法，當務之急是建立一套完整的檢測PCV的方法，及早開展PMWS的調查和防控研究，同時期待PCV疫苗的早日問世。
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