【豬細(xì)小病毒及其鑒別診斷研究】養(yǎng)豬技術(shù)

豬細(xì)小病毒及其鑒別診斷研究

84農(nóng)業(yè)網(wǎng)　　時(shí)間：2018-03-14 　　作者：佚名　　來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)整理

豬細(xì)小病毒是全世界豬群繁殖障礙最常見(jiàn)的病原之一。本病于1967年在英國(guó)報(bào)道以來(lái)，目前已廣泛流行于世界各地。我國(guó)于80年代初開(kāi)始研究此病，中國(guó)獸藥監(jiān)察所1.982年在國(guó)內(nèi)率先分離到該病毒。相關(guān)統(tǒng)計(jì)資料顯示豬細(xì)小病毒病已在我國(guó)普遍存在和流行。

豬細(xì)小病毒感染的經(jīng)濟(jì)損失也是巨大的。據(jù)美國(guó)每年由該病引起的繁殖損失達(dá)450萬(wàn)美圓，我國(guó)趙占民調(diào)查北京15個(gè)豬細(xì)小病毒陽(yáng)性場(chǎng)，1288頭初產(chǎn)母豬，產(chǎn)木乃伊和弱胎率59.16%，產(chǎn)死胎率49.17；廣西調(diào)查2024頭初產(chǎn)母豬，非正常子占產(chǎn)子總數(shù)的42.2%。

豬細(xì)小病毒感染引起母豬，特別是初產(chǎn)母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流產(chǎn)及病弱仔豬。敏感母豬在妊娠期最初70天內(nèi)感染此病毒就會(huì)發(fā)生此病。母豬返情、假孕（不分娩）、窩產(chǎn)仔數(shù)減少以及豬群總的繁殖性能下降。

但近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)該病毒是導(dǎo)致圓環(huán)病毒感染的一個(gè)協(xié)同病原，是后者流行的一個(gè)原因。而圓環(huán)病毒則是引起豬體質(zhì)下降、消瘦、腹瀉、呼吸困難，導(dǎo)致豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱的主要病原。

1病原學(xué)

豬細(xì)小病毒的病原是豬細(xì)小病毒，屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。病毒粒子呈圓形或六邊形、無(wú)囊膜，直徑為20nm，基因組為單股。病毒在豬原代細(xì)胞如：豬腎、豬睪丸細(xì)胞及傳代細(xì)胞如等細(xì)胞上都能生長(zhǎng)繁殖，并出現(xiàn)細(xì)胞病變，用免疫熒光技術(shù)可查出胞漿中的病毒抗原，病毒在細(xì)胞中可產(chǎn)生核內(nèi)包涵體。病毒能凝集人、候、豚鼠、小鼠及雞的紅細(xì)胞。

細(xì)小病毒毒力有強(qiáng)弱之分，（1）是強(qiáng)毒株，血清陰性懷孕母豬感染后將導(dǎo)致病毒血癥，并通過(guò)胎盤(pán)垂直感染使胎兒死亡；（2）是一種細(xì)胞適應(yīng)后的弱毒株，懷孕母豬感染后不能經(jīng)過(guò)胎盤(pán)感染胎兒，而被用作弱毒預(yù)苗株。毒株感染細(xì)胞中存在干擾缺損顆粒，可干擾或減患的復(fù)制，次種干擾作用為宿主機(jī)體建立起抵抗的免疫反應(yīng)提供足夠的時(shí)間，從而阻止病毒血癥的產(chǎn)生和繼發(fā)胎盤(pán)感染。

本病毒耐熱性強(qiáng)，在4℃極其穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。56℃30min加熱處理后其感染性和凝集紅細(xì)胞的能力不喪失，在70℃2h仍不喪失起感染性和血凝活性，到85℃5min才失活。

該病毒對(duì)各種消毒劑有很強(qiáng)的抵抗力。對(duì)乙醚、氯仿等脂溶劑不敏感，短時(shí)間胰酶處理不僅對(duì)病毒懸液沒(méi)有影響，而且還能提高其感染效價(jià)。甲醛蒸汽和紫外線也需要很長(zhǎng)時(shí)間才能殺死病毒。PPV在圈舍及排泄物中自然條件下可生存至少14周。用0.5%漂白粉或氫氧化鈉5min可殺死PPV，而2%戊二醛則需20分鐘，3%甲醛需2小時(shí)。

2流行病學(xué)

豬是已知的唯一易感動(dòng)物，不同年齡、性別的家豬和野豬都可感染。據(jù)報(bào)道，在牛、綿羊、貓、豚鼠、小鼠和大鼠的血清中也存在特異性抗體，來(lái)自病豬場(chǎng)的鼠類，其抗體陽(yáng)性率高于陰性豬場(chǎng)的鼠類。

帶毒豬是主要傳染源，病毒可通過(guò)胎盤(pán)傳給胎兒，形成垂直傳播，同時(shí)一側(cè)子宮角內(nèi)的胎兒感染PPV后，可傳播給另一側(cè)子宮角的胎兒。本病除可經(jīng)胎盤(pán)感染和交配、人工受精感染外，母豬、育肥豬和公豬主要是通過(guò)被感染的食物、環(huán)境經(jīng)呼吸道和消化道或生殖道感染。帶毒豬的分泌物和排泄物可保持感染數(shù)月，污染的圈舍是PPV的主要儲(chǔ)藏所，所以污染的豬舍在病豬移出后空圈四個(gè)半月，經(jīng)通常方法清掃后，當(dāng)再放進(jìn)易感豬時(shí)，仍有可能被感染，

子宮內(nèi)感染的仔豬至少可帶毒9周，有些具有免疫耐性的可能終生帶毒和排毒。感染本病毒的母豬所產(chǎn)的死胎、活胎、仔豬及子宮分泌物中均含有高滴度的病毒。

被感染公豬的精細(xì)胞、精索、附睪和副性腺都可分離出病毒，在其配種是易傳給易感母豬。

熒光抗體檢查證明病毒主要分布于豬體內(nèi)一些增生迅速的組織，如淋巴生發(fā)中心、結(jié)腸固有層、腎間質(zhì)、鼻甲骨膜等。

3臨床表現(xiàn)

本病常見(jiàn)于初產(chǎn)母豬，一般呈地方流行性或散發(fā)。在本病發(fā)生后，豬場(chǎng)可能連續(xù)幾年不斷地出現(xiàn)母豬繁殖失敗。母豬懷孕早期感染時(shí)，其胚胎、胎豬死亡率可高達(dá)80%～100%。

豬急性感染PPV1～6天后可產(chǎn)生病毒血癥，1～2周可通過(guò)糞便排毒，7～9天可在血清中檢測(cè)掃血凝抗體。

仔豬和母豬的急性感染通常都表現(xiàn)為亞臨床病例，但在其體內(nèi)很多組織器官（尤其是淋巴組織）中均可發(fā)現(xiàn)有病毒存在。母豬不同孕期感染，可分別造成死胎、木乃伊胎、流產(chǎn)等不同癥狀。在懷孕30～50天感染時(shí)主要是木乃伊胎。懷孕50～60天感染是多出現(xiàn)死產(chǎn)。懷孕70天感染的母豬則常出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀。母豬在懷孕中后期受感染后也可發(fā)生經(jīng)胎盤(pán)的感染，但此時(shí)胎兒常能在子宮內(nèi)存活而無(wú)明顯的臨床癥狀。在懷孕期70天后，大多數(shù)胎兒能對(duì)病毒感染產(chǎn)生有意義的免疫應(yīng)答而存活，但這些仔豬常帶有抗體和病毒。當(dāng)早期胚胎受感染時(shí)，病毒在子宮內(nèi)的傳播可能較不常見(jiàn)，因?yàn)榕咛ニ劳龊罂杀荒阁w迅速吸收而有效地清除了子宮內(nèi)的傳染源。

此外，本病還可引起產(chǎn)仔瘦小、弱仔，母豬發(fā)情不正常，久配不孕等癥狀。對(duì)公豬的受精率或性欲沒(méi)有明顯影響。

4病變

眼觀病變?yōu)槟肛i子宮內(nèi)膜有輕微炎癥，胎盤(pán)有部分鈣化，胎兒在子宮有被溶解、吸收的現(xiàn)象。感染胎兒還可見(jiàn)充血、水腫、出血、體腔積液、脫水（木乃伊化）及壞死等病變。

組織學(xué)病變?yōu)槟肛i的妊娠黃體萎縮，子宮上皮組織和固有層有局灶性或彌散性單核細(xì)胞浸潤(rùn)。感染胎兒死亡后可見(jiàn)多種組織和器官有范圍廣泛的細(xì)胞壞死、炎癥和核內(nèi)包涵體。在大腦灰質(zhì)、白質(zhì)和軟腦膜偶以增生的外膜細(xì)胞、組織細(xì)胞和漿細(xì)胞形成的血管套為特征的腦膜腦炎變化，一般認(rèn)為這是本病的特征性病變。

5診斷

如果發(fā)生流產(chǎn)、死胎、胎兒發(fā)育異常等情況而母豬沒(méi)有明顯的臨床癥狀，同時(shí)有其他證據(jù)可認(rèn)為是一種傳染病時(shí)，應(yīng)考慮到本病的可能性。但最后確診必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢查。可將一些木乃伊化胎兒或這些胎兒的肺送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷。大于70日齡的木乃伊化胎兒、死產(chǎn)仔豬和初生仔豬則不宜送檢，因其中可能含有干擾檢驗(yàn)的抗體。

本病應(yīng)注意與豬偽狂犬病、豬乙型腦炎和布魯氏病等鑒別診斷。

6防制

本病尚無(wú)特效的治療方法。主要采取的措施：控制帶毒豬傳人豬場(chǎng)。在引進(jìn)豬是應(yīng)加強(qiáng)檢疫，當(dāng)抗體滴度在1∶256以下或陰性是方可準(zhǔn)許引進(jìn)。引進(jìn)豬應(yīng)隔離飼養(yǎng)2周后，在進(jìn)行一次抗體測(cè)定，證實(shí)是陰性者，方可與本場(chǎng)豬混飼。一旦發(fā)病，應(yīng)將發(fā)病母豬、仔豬隔離或淘汰。所有豬場(chǎng)環(huán)境、用具應(yīng)嚴(yán)密消毒，并用血清學(xué)方法對(duì)全群豬進(jìn)行檢查，對(duì)陽(yáng)性相豬應(yīng)采取隔離或淘汰。以防進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)豬進(jìn)行免疫接種，有良好的預(yù)防效果。美國(guó)一研制成弱毒疫苗和滅活苗，對(duì)初產(chǎn)母豬進(jìn)行免疫接種，能有效預(yù)防母豬感染細(xì)小病毒。滅活苗免疫期可達(dá)4個(gè)月以上。我國(guó)已研制出滅活疫苗，在母豬配種前1～2個(gè)月左右免疫，可預(yù)防本病發(fā)生。仔豬的母源抗體可持續(xù)14～24周，在抗體效價(jià)1∶80是可抵抗豬細(xì)小病毒感染，因此，在斷奶時(shí)將仔豬從污染豬群移到?jīng)]有本病污染的地區(qū)飼養(yǎng)，可以培育出血清陰性豬群。

綜合以上種種，鑒于細(xì)小病毒危害的嚴(yán)重性和臨床癥狀的不明顯性，早期診斷是預(yù)防的關(guān)鍵，所以找尋一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法將是我們所要解決的首要問(wèn)題。

目前，我們已經(jīng)建立了許多種細(xì)小病毒的診斷方法。主要包括（1）病原學(xué)方面：進(jìn)行病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定或血凝實(shí)驗(yàn)或熒光抗體染色實(shí)驗(yàn)。用熒光抗體檢查病毒抗原是一種可靠和敏感的診斷方法。但其需要熒光顯微鏡這一特殊的設(shè)備，因此限制了該方法在臨床的推廣。

（2）血清學(xué)方面：血清中和實(shí)驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等，都可用于檢測(cè)本病毒的體液抗體。其中常規(guī)診斷方法是血凝抑制實(shí)驗(yàn)。病料可采取母豬血清，也可用70日齡以上感染胎兒的心血或組織浸出液。被檢血清先經(jīng)56℃30滅活，加入50%豚鼠紅細(xì)胞（最終濃度）和等量的高嶺土，搖勻后放室溫15min，經(jīng)2000r/min離心10min取上清，以除掉血清中的非特異性凝集素和抑制因素。抗原用4個(gè)血凝單位的標(biāo)準(zhǔn)血凝素，紅細(xì)胞用0.5%豚鼠紅細(xì)胞懸液。判定標(biāo)準(zhǔn)暫定1∶256。但其存在一定的不足之處，如實(shí)驗(yàn)所需的紅細(xì)胞要現(xiàn)配現(xiàn)用，最多只能保存1周，被檢血清的處理也較為煩瑣。

可見(jiàn)，使用方便、經(jīng)濟(jì)適用、簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確可靠，適應(yīng)規(guī)�；B(yǎng)殖的早期診斷和及時(shí)預(yù)防的需要的鑒別診斷方法為人們眾望所歸。為此，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒研究室研制開(kāi)發(fā)出豬細(xì)小病毒鑒別診斷試劑盒。

7診斷試劑盒研制的生物學(xué)基礎(chǔ)

細(xì)小病毒作為最小最簡(jiǎn)單的一類單鏈線狀DNA病毒，具獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)，其中多種自主型細(xì)小病毒的基因組結(jié)構(gòu)非常相似。PPV具有細(xì)小病毒的一般特性，其基因組為單鏈線狀負(fù)性DNA。其兩端均為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3’端102個(gè)堿基的回文序列被2個(gè)大小約10個(gè)堿基的短回文序列間隔，從而形成“Y”形結(jié)構(gòu)，而5’端127個(gè)堿基的回文序列，被24個(gè)堿基的短回文序列間隔，折疊成“U”形結(jié)構(gòu)。PPV基因組含有兩個(gè)互不重疊的主要開(kāi)放閱讀框架（OpenReadingFrame）。位于3’端的主要編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP，VP2）；5’端的主要編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSl，NS2，NS3）。非結(jié)構(gòu)蛋白的功能表現(xiàn)為：

（1）非結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)小病毒DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有重要作用，NSl蛋白具有內(nèi)切酶作用和共價(jià)結(jié)合5’端序列的特性，從而能共價(jià)結(jié)合復(fù)制型DNA5’末端并具有特意部位的解鏈活動(dòng)。NSl蛋白有A型保守序列，這類序列是與ATPase和GTPase相關(guān)的ATP和GTP結(jié)合位點(diǎn)，并具有解旋作用，它拓展了病毒DNA的末端的空間構(gòu)型，起始病毒DNA的復(fù)制，所以NSl蛋白是細(xì)小病毒DNA復(fù)制所必需的。

（2）NSl蛋白與細(xì)小病毒的組裝密切相關(guān)。PPV新合成的單鏈DNA基因組的5’端通過(guò)共價(jià)鍵與NSl聯(lián)結(jié)，在隨后的病毒包裝過(guò)程中NSl被去掉并連在病毒粒子的外層。

（3）非結(jié)構(gòu)蛋白NSl具有抗原性，并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。NSl雖然是微量的，但在病毒復(fù)制中，能持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。當(dāng)豬感染PPV后，體內(nèi)將產(chǎn)生抗NSl的抗體，而使用滅活苗免疫的豬則沒(méi)有這種抗體一基于此，利用桿狀病毒體外重組表達(dá)的NSl建立了區(qū)分PPV野毒感染和滅活疫苗免疫豬的鑒別診斷方法

8診斷試劑盒研制的過(guò)程

本研究在對(duì)PPV中國(guó)株的NSl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)細(xì)小病毒進(jìn)行了深入研究，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PPVNSl蛋白作為抗原，建立間接ELISA診斷方法。

通過(guò)大量臨床血清的檢測(cè)證實(shí)：

（1）特異性實(shí)驗(yàn)：用NSl包被微孔板，分別檢測(cè)豬口蹄疫、豬偽狂犬等豬的陽(yáng)性血清，檢測(cè)結(jié)果都呈陰性。表明，此診斷方法對(duì)豬細(xì)小病毒病的檢測(cè)具有特異性，是一種準(zhǔn)確而使用簡(jiǎn)便的診斷方法。

（2）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)診斷試劑盒在室溫下放置的有效使用期可以達(dá)到5個(gè)月。

（3）靈敏性實(shí)驗(yàn)證實(shí)其比常規(guī)的診斷方法，如HI和LAT等更為靈敏，尤其可以鑒別診斷自然感染和滅活苗免疫豬群。

（4）此診斷方法對(duì)于大量血清檢測(cè)具有省時(shí)、便捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，更適應(yīng)規(guī)模化養(yǎng)殖的早期診斷和及時(shí)預(yù)防的需要。

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